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抗體親和提取(AAE?):革新宿主細胞蛋白(HCPs)分析的新篇章

在生物制藥領域,對宿主細胞蛋白(HCPs)的精準分析與控制是確保藥物安全與有效性的關鍵環(huán)節(jié)。各國法規(guī)都有關于HCPs的論述,要求必須對生物藥品進行分析和純化,以將宿主細胞蛋白HCPs降低到可接受的水平。

 

不同監(jiān)管機構宿主細胞蛋白(HCPs)法規(guī)要求:


  • 《中國藥典》(2020)三部規(guī)定:針對CHO細胞,HCPs殘留需要<0.05%(相當于小于500ppm);針對E.coliHCP殘留需要<0.01%
  • 美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定:用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCPs,其含量應該低于檢測限(通常小于100ppm,即1mg總蛋白中HCPs含量應小于100ng,也即<0.01%)。
  • 歐洲藥典EP 2.6.34中規(guī)定:在生物制品中,HCP的含量應當小于0.1%
  • 國際人用藥品注冊技術協(xié)調會(ICH)指南:ICH Q6B指出,需要根據(jù)ICH準則采用敏感且經(jīng)過驗證的有效方法來監(jiān)控殘留的HCPs,其殘留量通常要求小于100ppm。
  • ELISA是各國藥典推薦的在生物制品中檢測殘留HCPs的方法,可以測定HCPs的總量。并且ELISA的操作簡便,是經(jīng)典的免疫學檢測方法。但ELISA檢測HCPs也有方法的局限性,比如不能從ELISA的結果中知道樣品中有哪些HCPs,或者用于檢測的抗體與哪些HCPs發(fā)生了免疫反應。因此,監(jiān)管部門要求在使用ELISA檢測過程中HCPs殘留含量時,不僅要通過方法學驗證證明試劑盒的準確度,精密度,靈敏度等,而且還需要證明使用的HCPs抗體有廣泛的反應性,即HCPs抗體覆蓋率。


1 HCP ELISA試劑盒檢測流程

 

什么時候做HCPs抗體覆蓋率驗證?

 

美國藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYSHCPs檢測方法分為:商業(yè)化試劑盒、產(chǎn)品/工藝專屬性方法和平臺化方法。指出在產(chǎn)品開發(fā)的不同階段,推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCPs的檢測。

USP<1132>提到在沒有平臺化方法的情況下可以在臨床前、臨床I期、II期使用商品化試劑盒;在臨床III/工藝驗證及產(chǎn)品上市后,由于商業(yè)化的通用HCP檢測試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性,需要考慮結合細胞類型及工藝特異性等因素,使用平臺化方法或針對上游工藝開發(fā)的產(chǎn)品/工藝專屬性方法。

而在臨床II期后若是需要繼續(xù)使用商品化試劑盒,就需進行HCPs抗體覆蓋率驗證來評估試劑盒是否可以繼續(xù)用于質量監(jiān)控。通常推薦在臨床II期末或者臨床三期前的這個階段去做覆蓋率驗證,此時生產(chǎn)工藝已經(jīng)固定并且有相對充足的時間。

 

2 USP <1132>產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測方法的建議

 

 

HCP覆蓋率驗證的不同技術路線

傳統(tǒng)的分析方法采用2D Western blot進行覆蓋率驗證,是基于等電點和分子量不同的原理,蛋白在凝膠上通過SDS-PAGE方法被分離。其中一張膠被銀染,另一張被轉到PVDF膜上,并結合ELISA試劑盒中的抗體進行Western Blotting檢測。但因其固有的方法學限制和技術挑戰(zhàn),往往難以全面、準確地評估多克隆抗體對HCPs的覆蓋范圍。

2D WB方法限制因素:


  • 負載能力低
  • 樣品經(jīng)過前處理會破壞蛋白天然表位
  • HCPs結合到PVDF膜上導致損失部分檢測到的抗體信息
  • 難以完全將PAGE凝膠與WB圖片對齊
  • 特異性差,顯著低估真實抗體覆蓋率


 

為了克服這一難題,Cygnus Technologies2014年創(chuàng)新性地推出了抗體親和提取(Antibody Affinity ExtractionAAE?)技術,目的是提高細胞培養(yǎng)收獲液中總HCPs混合物的靈敏度和覆蓋率評估,并可以檢測對下游工藝特異性HCPs的反應性,這些通常也是最為關注的HCPs。與2D-PAGE2D-WB的靈敏度受負載能力等限制不同,AAE?的靈敏度可高出100倍以上,因為它能夠提取和濃縮大量樣品。

 

1 AAE2D-WB覆蓋率技術路線對比

 

AAE

2D-WB

靈敏度

可富集mg級HCPs

靈敏度高(>95%)

因WB方法的局限性,覆蓋率被低估

靈敏度低(50-70%)

特異性

無變性處理特異性(>99.5%)

抗原變性處理后特異性結合(50-80%)

覆蓋率

AAE+2D-PAGE 60-90%

AAE-MS 70-95%

50-70%

適用性

純化前和純化后均可

只是適合純化前樣品

 

AAE分析流程首先將多克隆抗體共價固定在色譜柱上。然后對色譜柱進行條件調節(jié),以防止抗體的顯著浸出并極大地減少任何非特異性結合。原始未變性HCPs樣品通過色譜柱與抗體進行結合,隨后用酸洗脫。通過結合和洗脫,HCPs樣品再次在柱上循環(huán),直到?jīng)]有其他HCPs被結合。所有收集的HCPs洗脫再匯集、交換緩沖液并濃縮回原始樣品體積,為后續(xù)的分析提供高質量的樣本。在收集到HCPs樣本后,可以選擇通過2D-PAGE+銀染或MS質譜進行后續(xù)分析。




3 USP <1132>產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測方法的建議


抗體對下游HCPs的反應性和AAE-MS?HCPs鑒定


   AAE
?技術的優(yōu)勢不僅在于其高靈敏度,更在于其強大的預測能力和廣泛的應用前景。通過AAE-MS?獲得的覆蓋率的結果更高、更真實可以更準確地預測抗HCPs抗體ELISA中的表現(xiàn)。并且,AAE?與質譜聯(lián)用(AAE-MS?)能夠識別收獲材料中與抗體反應的HCPs,并獲得蛋白質的分子量和等電點(pI)信息,可以評估純化過程中持續(xù)存在的單個HCPs,并優(yōu)化下游純化工藝。

 

4 F650S HEK2 93抗體覆蓋率驗證

 

 

值得一提的是,AAE?技術在檢測并證明對單個下游HCP的反應性方面表現(xiàn)出色。更主要的是質譜可以對樣品中是否存在潛在高風險的HCPs做出鑒定并提供這些蛋白的注釋信息。通過AAE?技術,能夠更準確地識別量化這些高風險HCPs。這些通過特定純化過程持續(xù)存在的高風險HCPs對于患者安全、藥物功效和穩(wěn)定性至關重要無論是藥物研發(fā)人員還是監(jiān)管人員都能通過這一技術清楚地了解工藝中某個HCP的殘留情況,從而為藥物的研發(fā)和生產(chǎn)提供強有力的支持。

 

2 CHO細胞高風險HCPs

高風險蛋白(CHO

PRE

F550

F550-1

pl

MW

78 kDa glucose regulated protein (BiP, HSPA5)

N

Y

Y

5.07

72379.1

Cathepsin B(CTSB)

Y

Y

Y

5.73

35646.9

Cathepsin D

Y

Y

Y

6.54

44110.9

Cathepsin E

N

N

N

4.61

42726.4

Clusterin

Y

Y

Y

5.58

51557.5

Glutathione S transferase P

N

Y

Y

7.64

23638.2

Matrix Metalloproteinase 19

Y

Y

Y

7.71

58942

Monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1)

Y

Y

Y

9.32

15858.4

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase

Y

Y

Y

9.59

23634.4

….


AAE-MS?在藥物原液和過程樣品監(jiān)控中的應用

AAE-MS?也可以對藥物原液中HCPs富集的同時去除了大部分原料藥。去除原料藥極大地提高了通過2D-PAGE和質譜分析識別單個HCPs的能力,因為藥品通常以104-106的倍數(shù)掩蓋HCPsAAE-MS?是一種更客觀和直接的方法檢測和鑒定原料藥中任何潛在的HCPs雜質以幫助優(yōu)化下游純化工藝。

5 AAE對藥物原液中HCPs的富集

 

IMG_259

6  AAE-MS?對藥物原液中高風險HCPs的富集和鑒定

總之,抗體親和提取(AAE?)技術以其卓越的性能和廣泛的應用前景,正在逐步成為生物制藥領域HCPs分析的新標準。它不僅能夠克服傳統(tǒng)方法的局限性,更在靈敏度、預測能力和應用深度上實現(xiàn)了顯著提升。隨著技術的不斷發(fā)展和完善,相信AAE?將在未來為更多藥物的研發(fā)和生產(chǎn)貢獻力量,為患者帶來更加安全、有效的治療方案助力。

 

支持文獻

[1] USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.

[2] USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.

[3] EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.

[4] Host Cell Protein Analysis: Immunoassays and Orthogonal Characterization By Antibody Affinity Extraction and Mass Spectrometry Methods

[5] Antibody Affinity Extraction (AAE?) - A superior alternative to 2D Western blot for determination of polyclonal anti-HCP reactivity.

[6] Antibody Affinity Extraction (AAE?) Empowers HCP Identification by Mass Spectrometry.

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